mNGS 檢測技術(shù)簡介
mNGS 全流程包含樣本預(yù)處理、核酸提取、文庫構(gòu)建、文庫定量、上機測序等濕實驗環(huán)節(jié)，以及數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、分析等干實驗環(huán)節(jié)，其中濕實驗環(huán)節(jié)各階段均需要特定的實驗試劑來完成相應(yīng)的反應(yīng)流程。
杰毅生物通過多年的試劑研發(fā)，相繼推出去宿主試劑盒、DNA/RNA 抽提建庫試劑盒和 NGS 文庫定量試劑盒。
去宿主試劑盒
產(chǎn)品用途
本試劑盒用于去除高人源樣本（包括肺泡灌洗液、胸腹水、腦脊液、痰液等）的宿主 DNA，從而對微生物產(chǎn)生富集效果。經(jīng)驗證，本試劑盒能有效富集樣本中細菌、真菌、DNA 病毒、衣原體、支原體等臨床關(guān)切的病原微生物，大幅提升 mNGS 的檢測靈敏度。
產(chǎn)品優(yōu)勢
低耗時：總時間約為 15 分鐘（其他方法約 2-4 小時）
高效率：微生物總序列數(shù)占比平均提升 29.4 倍。
去宿主益處
1. 提升微生物檢出率，降低假陰性率。
2. 提升檢出微生物 RPM，增加鑒定可信度。
3. 提高微生物分辨率，鑒定到種，甚至亞種。
圖. 肺泡灌洗液樣本去宿主前后微生物檢出率對比
DNA/RNA 抽提建庫試劑盒
產(chǎn)品用途
本試劑盒用于樣本核酸提取和匹配 Illumina 高通量測序平臺下的宏基因組文庫構(gòu)建，包含 DNA/RNA 提取、RNA 逆轉(zhuǎn)錄（RNA 測序）、DNA/cDNA 片段化、末端補平、末端加 A、連接測序接頭、文庫純化等步驟，從而構(gòu)建出可用于 Illumina 高通量測序平臺的文庫。
產(chǎn)品優(yōu)勢
檢測結(jié)果更真實
首用 PCR-free 免擴增建庫技術(shù)，規(guī)避 PCR 偏好性和氣溶膠污染風險，反映樣本真實病原。
檢測功能更多樣
獨創(chuàng) Q-mNGS 定量技術(shù)，對樣本中人源和病原體核酸進行定量檢測，實現(xiàn)真/假陰性結(jié)果排查和抗感染療效監(jiān)控。
污染防控更高效
卡盒式檢測流程，單樣本單卡盒獨立空間檢測，規(guī)避樣本間較差污染風險。
圖. 檢測性能對比：PCR-free 建庫 vs. PCR 建庫，待檢微生物檢出 RPM 一致。
NGS 文庫定量試劑盒
產(chǎn)品用途
本產(chǎn)品可用于 illumina 測序平臺文庫進行快速、特異性的定量測試。優(yōu)化的預(yù)混液可縮短 real-time PCR 反應(yīng)時間，適用于標準或快速 PCR。即用型預(yù)混液中的熱啟動酶和獨特的 PCR 緩沖體系可確保在所有 real-time PCR 儀上進行靈敏的 qPCR，無需優(yōu)化。
操作流程
1. 按照下表設(shè)置反應(yīng)程序
| 階段 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時間 | 備注 |
| 預(yù)變性 | l× | 95℃ | 3 min | 酶活性激活 |
| 變性 | 25× | 95℃ | 5 sec | / |
| 退火涎伸 | 62℃ | 45 sec | 熒光信號收集 | |
| 熔解曲線分析 (Melting Curve Stage) | ||||
*熔解曲線分析為可選的，但在某些情況下，熔解曲線可以反應(yīng)文庫是否有非特異性擴增及引物二聚體的污染
2. 配置預(yù)混液 Mix (根據(jù)需求選擇反應(yīng)體系)
ROX 參考染料
根據(jù)選擇的儀器在反應(yīng)體系中加入 ROX 參考染料，將反應(yīng)體系中的熒光信號標準化。下表為不同儀器操作時所需的 ROX 量（10 μL 反應(yīng)體系）。
| 儀器 | 每 10μL 反應(yīng)體系所需的 ROX 量 |
| ABI 7300、7900HT、Step One 等 | 1 μL |
| ABI 7500、7500Fast、ViiA7、Stratagene、 Mx3000TM、Mx3005PTM 以及 Mx4000TM | 0.2 uL |
| Roche 儀器、Bio-Rad 儀器、Eppendorf 儀器等 | 無需添加 |
| 組分名稱 | 10μL 體系 | 20 μL | ||
| Rox | No Rox | Rox | No Rox | |
| QuantFast SYBR Green qPCR SuperMix | 5.0μL | 5.0 μL | 10.0μL | 10.0μL |
| Primer Premix | 1.0 μL | 1.0 μL | 2.0 μL | 2.0μL |
| 50xROX Dye（見上表） | 1.0 μL | / | 2.0 μL | / |
| Nuclease-Free Water | / | 補至 16 μL | 補至 16μL | |
3. 待測樣本：
(1) 10 μL 體系按照 6 μL/孔分裝 Mix，再加入 4 μL 的模板/標準品（1-5）；
(2) 20 μL 體系按照 16 μL/孔分裝 Mix，再加入 4 μL 的模板/標準品（1-5）。
4. 陰性對照（NTC）：
(1) 10 μL 體系 ：直接取 10 μL 的 Mix；
(2) 20 μL 體系 ：直接取 20 μL 的 Mix。
5. 蓋上反應(yīng)管，輕輕混勻，可稍微離心，確保所有組分都在管底。
6. 將反應(yīng)體系置于熒光定量 PCR 儀中，收集數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。
7. 數(shù)據(jù)分析：
熒光定量結(jié)果應(yīng)滿足：
Slope：-3.1 ~ -3.6，R2 ≥0.99，Eff%：90% ~ 110%，NTC 讀數(shù)為 0 或 Undetect。
8. 計算文庫濃度
采用絕對定量的方法，通過 452 bp 的標準品計算文庫的濃度
文庫濃度=QPCR 濃度*標準品片段大?。?52 bp）/文庫平均片段大小*稀釋倍數(shù)
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