導讀
實驗周期長、操作較復雜一直是宏基因組二代測序(mNGS)在臨床應用的主要限制因素。2022 年 3 月 15 日,檢驗醫學權威期刊《Clinical Chemistry》(2021 年影響因子 8.327)發表了北京協和醫院和杰毅生物聯合發表的重要研究論文。研究團隊通過改良測序接頭和開發了一套快速實時生信分析系統,并借助于杰毅生物自主研發的自動建庫儀器,實現了在 NextSeq 測序平臺上全流程最快 9.1 小時的多樣本 mNGS 檢測,進一步發揮 mNGS 在鑒定疑難、危重、特殊感染方面的優勢,為危急重癥患者的快速精準診療贏得寶貴的時間。
研究背景
宏基因組二代測序 (mNGS ) 具有無偏倚地檢測樣本中病原體的巨大潛力,也是鑒定新發突發病原微生物的重要手段,但其報告時限(TAT)較長(≥15h)。盡管 Oxford Nanopore Technologies(ONT)測序平臺提供了 TAT≤6 小時的測序和檢測分析方案,但相較于 Illumina 二代測序方法,依然存在測序深度和 Reads 產出較低,成本較高和測序錯誤率較高等不足。在面對各種疑似感染病癥時,臨床醫生始終有快速、準確鑒定病原體的迫切需求,因此,提升 mNGS 檢測時效性成為了臨床病原微生物檢驗關注的重點。
研究結果
改進測序接頭結構,實現 “快速、實時”mNGS 分析
圖 1 通過對測序接頭的改進,實現不影響測序質量前提下的快速、實時分析
受到現有測序接頭和測序原理的限制,NGS 只能先獲取全部樣本的測序數據,再根據標簽序列進行數據拆分,最后完成序列比對分析,該固有流程是導致二代測序實驗 TAT 較長的主要因素之一。本研究創新性地改良了測序接頭的結構,接頭中插入了一段樣本特異的內部標簽序列(Internal Index),實現了對內部標簽序列進行優先測序和測序數據的提前拆分分析。為了避免這種接頭設計導致的核苷酸多樣性缺失、測序質量不佳、產出數據不足的問題,研究者們組合搭配了三種不同長度(6、7 和 8bp)的內部標簽(圖 1)。這樣的設計能在保證測序質量的前提下,提前拆分分析樣本測序數據,實現快速實時的 mNGS 分析。
自動化+實時生信分析,最快 9.1 小時完成 mNGS 全流程
圖 2 改良的接頭設計,結合自動化建庫設備和生信實時分析流程,最終實現快速 mNGS
完成測序接頭的改良后,研究者開發了一套快速 mNGS 檢測方案,包括自動化文庫制備、Illumina NextSeq 測序平臺和實時分析系統(圖 2)。實時分析監控程序全程監測測序進度,并根據測序循環數調度分析任務。后續的性能驗證證實了改良的測序接頭實現了快速檢測,在 NextSeq 測序平臺的全流程 TAT 降低到了 9.1~10.1 小時 (圖 3,測序耗時約 6.1 小時,濕實驗耗時 3~4 小時)。而使用常規接頭,僅測序單一步驟耗時就達到約 11.7 小時,全流程周轉時間至少在 15 小時以上。
圖 3 測序分析耗時對比(改良的接頭 vs 經典 TruSeq 接頭)
準確性評估
圖 4 利用真實臨床樣本完成新方法的性能評估
為了進一步縮減測序時間、并評估整套實驗流程的準確性,研究者使用改良后的測序接頭對 153 個下呼吸道標本進行了快速實時 mNGS 檢測分析。研究者們綜合了標本的臨床培養、16S/ITS 測序、PCR-sanger 測序和病毒的 qPCR 驗證結果,形成一套復合標準,用于評價快速 mNGS 報告和常規 mNGS 報告的準確性(圖 4)。
圖 5 快速 mNGS 和常規 mNGS 結果的準確性評估
如圖 5 所示,基于復合參考標準,快速 mNGS 的細菌檢測能力達到了陽性符合率 85.1%,陰性符合率 100%;真菌檢測能力達到了陽性符合率 80.3%,陰性符合率 97.4%;病毒檢測能力達到了陽性符合率 96.8%,陰性符合率 98.0%。
總結
本研究基于杰毅生物 mNGS 自動化解決方案,創新開發了改良的測序接頭和實時快速分析系統,以 9.1 小時首次刷新了 Illumina NextSeq 測序平臺下的 mNGS 檢測速度,性能驗證結果證實這項 “既快又準” 的 mNGS 檢測技術有望為疑難、危重、特殊感染患者的救治提供更及時、更精準、更全面的診療線索,開創臨床感染精準診療的新局面。