近日，北京大學人民醫(yī)院檢驗科王輝教授團隊在國際著名的柳葉刀子刊《EBioMedicine》（IF=8.143）發(fā)表了題為 “Metagenomic next-generation sequencing to identify pathogens and cancer in lung biopsy tissue” 的研究論文。王輝教授為本文通訊作者，杰毅生物王珺博士和丁文超博士共同參與了此項研究。

不依賴培養(yǎng)、不需前提假設的宏基因組測序已成為診斷感染性疾病的有效方法，并迅速地從實驗室研究過渡到臨床應用。臨床對疑似感染患者進行 mNGS 以識別病原體，但惡性腫瘤患者與感染患者的部分臨床癥狀相似、難以鑒別，對此類患者進行常規(guī) mNGS 檢測時，結果可能為陰性。

染色體不穩(wěn)定性作為一種重要的腫瘤標志物，已在科學研究中進行廣泛討論，但在臨床診斷中應用較少。本研究基于 mNGS 可識別宿主染色體不穩(wěn)定性的原理，對 mNGS 用于同時檢測肺活檢組織中的病原體和染色體不穩(wěn)定性進行了研究，并且探討了基于 Illumina 和 Nanopore 測序平臺的宏基因組測序在肺活檢組織中的病原體診斷價值。結果顯示，以病理結果為金標準，mNGS 對于惡性腫瘤的臨床診斷敏感性、特異性、準確率分別為 83.7%、97.6%、92.9%；Illumina 測序在感染診斷中的敏感性和特異性分別為 77.6% 和 97.6%，而 Nanopore 測序的敏感性為 34.7%，特異性為 98.7%。本研究數(shù)據(jù)顯示 illumina 平臺在肺活檢組織的病原體檢測性能顯著優(yōu)于 Nanopore 平臺。

一．病人特征

本研究納入北京大學人民醫(yī)院檢驗科 133 例疑似肺部感染或胸部影像學異常的肺活檢組織標本，并根據(jù) CAP、HAP 和疑似感染的診斷標準，分為 LRTI 組（Lower respiratory tract infection, n=49）和非 LRTI 組（n=84）。非 LRTI 組的惡性腫瘤發(fā)生率明顯高于 LRTI 組（41.7% vs. 16.3%），LRTI 組血液病患病率明顯高于非 LRTI 組（14.3% vs. 3.6%）。LRTI 組抗生素使用發(fā)生率顯著高于非 LRTI 組，住院時間較非 LRTI 患者略長，白細胞計數(shù)、C 反應蛋白、降鈣素原均高于非 LRTI 組。

二、Illumina 和 Nanopore 平臺對肺活檢組織的病原體檢測性能

從標本接收到結果分析，Illumina 測序比 Nanopore 測序的 TAT 長，比常規(guī)培養(yǎng)的 TAT 短。培養(yǎng)陽性率為 13.5%（18/133），培養(yǎng)結合其他微生物檢測（包括 qPCR、ELISA、GeneXpert MTB/RIF 和組織學檢測等）的陽性率為 32.3%（43/133）。Illumina 測序的陽性率為 30.1%（40/133），與培養(yǎng)結果相比，敏感性和特異性分別為 83.3% 和 79.1%；與所有常規(guī)微生物檢測相比，敏感性和特異性分別為 74.4% 和 95.6%；與綜合參考標準相比，敏感性和特異性分別為 77.6% 和 97.6%。Nanopore 測序的陽性率為 14.6%（18/123），去除建庫失敗標本后，與培養(yǎng)結果相比，敏感性和特異性分別為 38.9% 和 91.4%；與所有常規(guī)微生物檢測相比，敏感性和特異性分別為 33.3% 和 97.5%，與綜合參考標準相比，臨床敏感性和特異性分別為 34.7% 和 98.7%。

三、結果不一致的標本信息

整體檢測性能比較：133 例肺活檢標本中培養(yǎng)到 20 例病原體，其中 2 例標本存在合并感染，8 例標本感染真菌，4 例標本感染抗酸桿菌，其余 8 例標本感染其他細菌。其他微生物檢測檢出 25 例其他病原體：BALF 培養(yǎng)鑒定 3 例，GM 試驗陽性 7 例，抗體陽性 1 例，PCR 檢測陽性 14 例。與 Illumina 測序和 Nanopore 測序結果對比發(fā)現(xiàn)：僅靠臨床常規(guī)微生物檢測識別病原體 9 例；Illumina 測序額外識別病原體 11 例；Nanopore 測序額外識別病原體 4 例；Illumina 和 Nanopore 測序均陽性，但臨床微生物檢測結果為陰性的有 3 例；臨床微生物檢測結果與 Illumina 或 Nanopore 測序結果完全一致的總計 38 例。

真菌檢測性能比較：2 例標本的培養(yǎng)結果與 Illumina 和 Nanopore 測序結果均不一致。臨床微生物檢測和 Illumina 測序均檢測到的真菌 7 例；臨床微生物檢測和 Nanopore 測序均檢測到的真菌 1 例；三類方法均檢測到的真菌 6 例；與臨床微生物檢測相比，Illumina 和 Nanopore 測序額外識別了 9 例真菌，且與組織病理結果一致。

分枝桿菌檢測性能比較：臨床微生物檢測檢出分枝桿菌 14 例，Illumina 和 Nanopore 測序分別檢出 10 例和 2 例，通過 Illumina 測序鑒定了 1 例抗酸桿菌陽性病原體為堪薩斯分枝桿菌。共計 4 例分枝桿菌僅有臨床微生物學檢出，Illumina 或 Nanopore 測序均未檢測到分枝桿菌屬，其中 1 例抗酸桿菌陽性，3 例 qPCR 陽性。

四、基于 Illumina 測序的染色體不穩(wěn)定性檢測

通過 Illumina 測序獲得標本中的宿主序列，對 127 個肺活檢組織標本（43 例組織學上確診為惡性腫瘤）進行染色體不穩(wěn)定性分析，對腫瘤進行診斷。mNGS 共檢測到 36 例腫瘤患者，其中 31 例為臨床和病原 mNGS 檢測陰性的患者，5 例為病原體檢測陽性患者。與病理檢查結果比較，mNGS 對于腫瘤診斷的臨床敏感性為 83.7%，特異性為 97.6%，準確率為 92.9%。經臨床結果證實，基于 Illumina 平臺的 mNGS 同時檢測到 38 例感染患者和 36 例癌癥患者（包括 18 例初診肺陰影、占位性病變或結節(jié)的患者）。

本研究首次證明了使用 mNGS 可以在肺活檢組織標本中同時檢測病原體感染和腫瘤。作者指出，基于 Illumina 測序平臺的 mNGS，分別以培養(yǎng)、微生物檢測和綜合參考為標準時，其敏感性較高；而 Nanopore 測序的靈敏度遠低于此前報道，原因可能在于肺活檢組織中病原體濃度可能低于體液，以及宿主背景（人源含量）較高。

研究發(fā)現(xiàn) mNGS 可提高肺部真菌感染的診斷敏感性，與此前研究結果類似，有利于應對近年來肺部真菌感染發(fā)病率上升且早期診斷困難的現(xiàn)象，但作者建議在通過 mNGS 診斷真菌感染時，需結合其他臨床檢測方法（如 GM 試驗或病理檢測），以規(guī)避 mNGS 匯報背景污染的風險。本研究中 mNGS 對于分枝桿菌的檢測敏感性較低，與此前報道不完全一致，可能是由于結核分枝桿菌序列數(shù)較低以及不同研究的波動性相關。本研究也對 mNGS 檢測到 CMV 和 EBV 的患者進行分析，提出 CMV 和 EBV 在健康人群血液中也可以檢出，但皰疹病毒的激活在造血干細胞移植后較常見，且與預后不良有關，因此建議 mNGS 檢測到 CMV 或 EBV 時，應根據(jù)標本類型和臨床癥狀進行解讀。

另外，該研究首次指出，來自 mNGS 的宿主序列可以用于檢測腫瘤患者的染色體不穩(wěn)定性，且有助于提高腫瘤診斷的準確性和時效性（病理檢查 TAT 約 48 小時），并降低檢測成本，但仍存在少數(shù)標本的假陽性（2 例）和假陰性（7 例），因此需要根據(jù)更大的隊列研究結果對判讀閾值進行調整。研究還指出對于 Nanopore 測序平臺而言，優(yōu)勢在于序列讀長而非序列數(shù)量，而人源含量的高低會影響基因組的覆蓋度，進而影響染色體不穩(wěn)定性的判讀。因此應用 Nanopore 測序平臺的腫瘤判讀模型仍要進一步調整。

綜上所述，本研究首次報道了基于 Illumina 測序平臺的 mNGS 在肺活檢組織標本中同時診斷感染和腫瘤。該技術可以有效地對影像學異常如肺部陰影、占位性病變或結節(jié)的患者提供腫瘤診斷。本研究建議在 Nanopore 測序的濕實驗中進行去宿主操作，以提高病原體的檢測敏感性。